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Marchack
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BAC (Bacterial Artificial Cromosome)
Tipo di vettore che permette di inserire fino a 300Kb di inserto, è stato creato usando come modello il plasmide F (fattore di fertilità responsivo della coniugazione batterica), grazie ai geni del fattore F che conferiscono al vettore una bassa percentuale di co-clonazione e ricombinazione interna è presente solo in 1 o 2 copie per cellula. E' molto stabile nelle generazioni, e per la trasformazione batterica con questo vettore si usa l'elettroporazione.
Elementi Strutturali importanti:
Geni regolatori derivati dal fattore F di E. coli:
- oriS, repE: consentono replicazione unidirezionale
- parA, parB: mantenimento di un solo vettore per cellula
CMr: resistenza al cloramfenicolo
Segmento di clonaggio:
- BamH1 e HindIII: siti di clonaggio dell’inserto
- T7 e SP6: promotori fiancheggianti i siti di clonaggio per la eventuale generazione di sonde a RNA (chromosome walking)
- CosN: sito di restrizione, tagliato dalla terminasi di fago l
- LoxP: sito di restrizione, tagliato dalla proteina CRE del fago P1
- NotI, EagI, XmaI, SmaI, BglI e SfiI: siti di restrizione
PAC (P1 derived Artificial Chromosome)
Molto simili a BAC, può avere inserti anche fino a 300Kb, ma la dimensione più usata e meglio gestita dal vettore è di 150Kb. Presente in 1 o 2 copie grazie al gene P1 Replicon che conferisce al vettore una bassa percentuale di co-clonazione e ricombinazione interna, può però essere indotto ad una replicazione in multicopia con isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside grazie al Lytic Replicon presente sul vettore.
Elementi strutturali:
- P1 Replicon: consente la replicazione unidirezionale, una copia per cell.
- KanR: resistenza alla Kanamicina
- Lytic Replicon: consente la replicazione multicopia del vettore nella cellula. E’ sotto il controllo del promotore dell’operone Lac. Normalmente il PAC è mantenuto in cellule esprimenti il repressore LacI (funziona solo P1 Replicon), prima di compiere analisi di restrizione o subclonaggi viene aggiunto isopropyl b-D-thiogalactopyranoside (IPTG) che inattiva LacI (Lytic Replicon funziona)
- PUC19Link: viene eliminato, al suo posto si inserisce il frammento da clonare
- BamH1: Sito di clonaggio
- T7 e SP6: promotori fiancheggianti per eventuali sonde RNA (chromosome walking)
- Sistema per la selezione positiva dei ricombinanti: il prodotto del gene SacBII (controllato dal promotore di E. coli) tossico per la cellula in presenza di saccarosio non può essere trascritto se ho l’inserto
- LoxP: sito di restrizione, tagliato dalla proteina CRE del fago P1
- NotI, SalI, ScaI: Siti di restrizione
Per la possibilità di avere grossi inserti è stato usato nel Progetto Genoma Umano (Human Genome Project): infatti, a differenza della Celera, nell HGP è stata usata la tecnica del Clone Contig, in cui il genoma veniva spezzettato e clonato, solo successivamente sequenziato, posizionando i frammenti (contig) su una mappa di marcatori genetici, e derivando la sequenza intera dalle sovrapposizioni dei frammenti.
Fonte
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[GENETICA/BIOLOGIA] Vettori Bac e Pac |
