[GENETICA/BIOLOGIA] PCR (Polymerase Chain Reaction)

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  1. Marchack
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    La PCR (Polymerase Chain Reaction) è un metodo attraverso cui una sequenza di acido nucleico più essere amplificata esponenzialmente in vitro. Lo stesso metodo può essere usato per modificare la sequenza amplificata o per aggiungerle nuova informazione di sequenza. È necessario che le estremità della sequenza da amplificare siano conosciute con sufficiente precisione per poter sintetizzare degli oligonucleotidi che saranno ibridizzati ad esse, e che una piccola quantità della sequenza sia disponibile per dare inizio alla reazione. Non è necessario che la sequenza da sintetizzare enzimaticamente sia inizialmente presente in forma pura; essa può anche essere una frazione minoritaria di una miscela complessa, come un segmento di un gene a singola copia nel DNA totale umano. La sequenza da sintetizzare può essere presente inizialmente come una molecola discreta oppure può essere parte di una molecola più grande. In entrambi i casi, il prodotto della reazione sarà una molecola discreta di dsDNA con estremità corrispondenti a quelle 5' degli oligomeri utilizzati.

    UN TIPICO CICLO DI PCR:
    1. Denaturazione al calore di uno stampo di DNA che deve essere copiato (94 - 99 °C)
    2. Appaiamento (annealing) di coppie di oligo, (30 - 65 °C)
    3. Estensione da parte di DNApol termoresistente a partire dai primer. (65 - 72 °C)

    La scelta delle condizioni operative del ciclo (tempo e temperatura) è compito dell'operatore, è una scelta empirica e non prefissata.
    Un passaggio graduale tra la temperatura di annealing e la temperatura di estensione permette alla Taq di iniziare l'elongazione senza che i primers si stacchino (T>Tm). Via via che la Taq polimerizza la Temperatura supera i 72 °C e rincomincia il ciclo con la denaturazione.
    Durante il primo ed ogni successivo ciclo di reazione, l'estensione di ogni oligonucleotide sullo stampo originale produrrà una nuova molecola di ssDNA di lunghezza indefinita. "Questi prodotti lunghi" si accumuleranno in maniera lineare, cioè la loro quantità dopo un numero qualsiasi di cicli sarà linearmente proporzionale allo stesso numero di cicli. I "prodotti lunghi" originati in questo modo fungeranno da stampi per l'uno o l'altro degli oligonucleotidi durante i cicli succcessivi, e l'estensione di questi oligonucleotidi dalla polimerasi produrrà molecole di una lunghezza definita, corrispondente a quella della sostanza di interesse. Queste molecole fungeranno anch'esse come stampi per l'uno o per l'altro oligonucleotide producendo altre molecole di grandezza definita. In questo modo si svilupperà una reazione a catena che porterà all'accumulo di uno specifico dsDNA in maniera esponenziale rispetto al numero di cicli di reazione. Il grado di amplificazione finale è dato da 2^(n-2) dato che i primi due cicli sono nulli.

    REAGENTI PER LA PCR.
    TEMPLATO
    I risultati migliori si ottengono con frammenti non superiori a 1.5 kb. Il numero di cicli non deve superare la cinquantina, poiché dopo un certo numero di cicli l'amplificazione non è più esponenziale ma raggiunge un plateau dovuto a:
    1. carenza di oligo,
    2. carenza di dNTP,
    3. aumento di PPi,
    4. comparsa di DNA parassita amplificato.
    Se la sequenza è ricca di GC si aggiunge DMSO (Dimetil solfossido) e si usa la 7-aza-dGTP al posto del dGTP, ponendo attenzione che questo non inibisca la DNA polimerasi.

    Il templato può essere:
    1. Omogeneo (plasmide purificato) ogni molecola è identica e rappresenta la sequenza da amplificare, il vantaggio è che poche molecole bastano a garantire l'amplificazione
    2. Eterogeneo (mix di diverse molecole di DNA, come il DNA genomico, sospensione cellulari o materiale biologico) Devo usare molto DNA per avere un minimo sufficiente per garantire l'amplificazione.
    Anche la purezza e il materiale di partenza contano: l'enzima può subire o meno impedimento sterico per raggiungere il templato. In questi casi, caso per caso si introducono accorgimenti particolari atti a minimizzare il disturbo.
    In generale bisogna evitare tutti i contaminanti chimici che non permettano l'attività polimerasica efficace.
    Alla fine dell'estrazione dobbiamo tirare via tutto: EDTA chela il Mg++, indispensabile per le polimerasi; gli ac.forti, i sali che potrebbero fare complessi nel sito attivo dell'enzima e inibirlo e, in linea teorica tutte le sostanze che interferiscono con l'attività enzimatica (sono tutte scritte sulla boccettina di enzima) se fra i non desiderati c'è qualcosa che è stato usato per separare il DNA, andrà eliminato sicuramente.

    PRECURSORI (DNTP)
    Devono essere bilanciati, perché se ce n'è uno in concentrazione limitanti l'enzima o incorpora qualcos'altro o si ferma. Ovviamente contano anche la lunghezza: 500 bp necessitano di una concentrazione di dNTP minore di una sequenza di 5000 bp, così come di n° di cicli di reazione. Ricordiamo che negli ultimi cicli la quantità di templato polimerizzata è molto elevata.

    OLIGO
    - Prodotti in vitro per sintesi chimica, non sono ammesse preparazioni non pure per quanto riguarda la composizione in basi, o l'ampli non sarà specifica.
    - Questo significa anche limitarsi ad un range di dimensioni da 18 a 30 nt, dopodiché il rischio di non precisione e il costo dell'oligo li rende non adatti per la PCR.
    - Non devono essere limitanti ma non devono essere nemmeno in eccesso (aumenta il rischio di dimerizzazione).
    - La coppia di oligo deve avere temperature di denaturazione simili (Tm1~Tm2).

    SCELTA DELLA TM

    Più la Tm (temperatura di fusione, quella per la denaturazione del DNA) è alta e più aumenta la probabilità che gli oligo si appaiano specificatamente, quindi quelli completamente omologhi al templato.
    La Tm si calcola con formule empiriche.
    · Ad una costante fissa viene aggiungo un contributo positivo che deriva dalla ricchezza in GC dell'oligo (maggior contributo alla stabilità) e aggiungo un contributo negativo: oligo molto corti hanno in proporzione meno interazioni fra le basi e quindi tenderanno a staccarsi dal templato a temperature più basse. Questo è l'algoritmo correntemente utilizzato.
    · C'è poi il caso particolare nel calcolo della Tm per gli oligo che non sono completamente omologhi soprattutto nelle regioni centrali: un non omologo all'estremità può essere, per assunto, solo l'appaiato. Ma se la zona non omologa si trova al centro l'assunzione non si può fare: per trovare la Tm esiste una formula (che ha una diversa costante fissa) che tiene conto del contributo negativo della parte non appaiata (% di mismatch).
    · Non deve verificarsi self annealing: i due oligo non devono appaiarsi fra loro, altrimenti la concentrazione di oligo effettiva nella miscela di reazione si abbassa notevolmente. Non solo, se l'appaiamento è solo fra le code queste si distendono ed avremo eterodimeri di oligo, la polimerasi polimerizzerà un oligo, ed ai cicli successivi si appaieranno altri oligo e, alla fine, troveremo piccole molecole (100 bp circa) che sono state ottenute da una sequenza in tandem di oligo. Questa miscela sottrae attività enzimatica, sottrae oligo, nucleotidi e quindi riduce notevolemnte l'efficienza d'amplificazione. In particolare non si devono anilare in corrispondenza del 3', è ovvio, perché è qui che comincia la polimerizzazione e, se si annilano qui, l'allungamento è compromesso.
    · La sequenza non deve permettere formazioni di stem loop.
    · L'appaiamento col templato deve essere stabile, quindi valuto
    1. Il grado di purezza delle preparazioni (i detergenti destabilizzano l'anniling) se so che il materiale non è purificabile quello che si fa è allungare l'oligo e sceglierlo in maniera tale che sia il più univoco possibile;
    2. La temperatura di annealing
    · Se nella sequenza dell'oligo c'è un sito dei restrizione, non è detto che debba appaiarsi (oligo con le ali) ho la comodità che, una volta fatta l'amplificazione, posso tagliare a quel livello e introdurre direttamente nel plasmide.
    Esistono software per la scelta dei primer:
    OLIGO SOFTWARE: Oligo Analyzer 1.0 e Oligo Explorer 1.0 (da installare)
    OLIGO CALCULATOR (on line)
    WEB PRIMER (on line)

    MG++
    Non deve essere limitante: tutto ciò che metabolizza polimeri di nucleotidi necessita di Mg++.
    Se è largamente eccedente determina inaccuratezza, aumentando la frequenza degli appaiamenti degli oligo con sequenza non omologhe: le 2 cariche positive possono interagire con i fosfati e dare stabilità all'appaiamento. Stabilizzando gli omologhi, stabilizzano anche i non omologhi, e questo va evitato.
    La [Mg++] ottimale si determina tenendo conto che può essere legato sui fosfati di DNA ds, Oligo e dNTP; sommando queste concentrazioni (conto stechiometrico/spannometrico) più la [compatibile] con l'attività enzimatica. Si va a spanne: si guarda l'ordine di grandezza molare.

    EQUIPAGGIAMENTO
    Oggi esistono termociclatori automatizzati che permettono di impostare il ciclo e fanno tutto loro con tutti i cambi di temperatura. Purtroppo tra di loro sono soggetti a variabilità, è meglio quindi che in un laboratorio ci siano termociclatori dello stesso modello. È conveniente usare sempre lo stesso tipo di provette per tenere costane l'inerzia termica della provetta.

    SE ABBIAMO ALLESTITO UNA PCR IN CONDIZIONI NON OTTIMALI.
    .quello che succede è che uno degli oligo si appaia in una zona non desiderata. L'appaiamento scorretto porta ad un abbondante presenza di un amplificato di dimensioni scorrette. (Non è che gli appaiamenti scorretti siano rilevabili solo dopo tanti cicli di reazione: se si verificano si verificano dall'inizio, quindi non è vero che facendo 40 cicli piuttosto che 20 si aumenta la probabilità di osservare fenomeno. È chiaro che, per una questa di frequenza sarebbe vero, ma la proporzione è così bassa che il caso sporadico è poco rappresentato).
    Il principale problema della tecnica di PCR è la contaminazione da prodotti di amplificazioni precedenti che può causare amplificazione di DNA parassita (falsi positivi)

    COME SOPPRIMERE LE CONTAMINAZIONI

    1. PRECAUZIONI.
    PCR in stanze separate dalle altre operazioni, vetreria dedicata solo a PCR, massima sterilità.
    2. HOT STAR PCR
    Ovvero PCR con partenza a caldo, si tratta di aggiungere la Taq velocemente subito dopo il primo lungo step di denaturazione. Lo stratagemma ha lo scopo di aumentare la specificità dell'annealing elongato.
    3. NESTED PCR
    Si tratta di realizzare due PCR successive utilizzando coppie di primers differenti, con la seconda che inquadra una sequenza inclusa in quella amplificata dalla prima coppia.
    Se la prima amplificazione è artefattuale, nella seconda i primers non si appaieranno!
    In questo modo aumento:
    - Specificità
    - Tasso di amplificazione
    4. DUTP + UNG.
    Amplifico fornendo dUTP anziché dTTP
    Dopo l'amplificazione lavo la provetta con UNG quindi con una scaldata denaturo UNG.
    Uso la provetta priva di DNA per un altro ciclo di reazione con un nuovo templato.

    CLONAGGIO DEI PRODOTTI DI PCR.
    Abbiam visto che è possibile inserire negli oligonucleotidi dei siti di restrizione, che comodità:
    sample 1) amplifico -> digerisco
    sample 2) digerisco il plasmide
    sample 3) mix sample 1) & 2) and aggiungo ligase.
    Ora trasformo.
    L'estremità degli amplificati è un'altra caratteristica che differenzia Taq e Pfu:
    · TAQ molto spesso lascia delle basi in più sull'elica 3' come single strand. Spesso sono delle A (o T). Sistemi in commercio sfruttano questo A per farle legare in plasmidi in cui sono stati messe delle poli-A.
    · PFU produce amplificati blunt, quindi o usiamo plasmidi blunt o usiamo la terminal transferasi. Allestiamo una reazione in cui mettiamo soltanto delle A, ed otteniamo un amplificato Pfu con la coda di poli-A, che a questo punto può essere clonata in un plasmide commerciale che presenta la coda di poli-T.

    CLONAGGIO DI DNA DI ORGANISMI NON COLTIVABILI.
    Mettiamo di partire da DNA genomico digerito con un enzima, quindi una soluzione estremamente eterogenea di frammenti di cui conosciamo però le estremità (derivanti dall'enzima di restrizione usato). Essendo eterogenea non possiamo decidere a priori quali oligo usare per amplificare tutti i frammenti che abbiamo: perché non bastano le basi del sito di restrizione (4-10) per costruire l'oligo. Come si fa? Possiamo fare una ligazione a livello delle estremità (che conosciamo) e alla ligazione attacchiamo una coda (o linker) di cui conosciamo tutta la sequenza perché l'abbiam sintetizzato in vitro.
    È su quel linker che andremo a costruire gli oligonucleotidi complementari, e siam pronti per fare la PCR. Arriviamo alla fine con molecole di questo tipo: il frammento centrale a sequenza sconosciuta, più coda esterna con sito di restrizione, che abbiamo avuto la cura di ricostruire completamente, e altre basi. Ora ridigeriamo con l'enzima di partenza (quello con cui avevamo tagliato il templato all'inizio) otteniamo un amplificato che è già pronto per essere riclonato in un plasmide che porti la sequenza per l'enzima che abbiamo usato all'inizio. Rispetto agli altri metodi, questo ha un passaggio in più: la ligazione iniziale. Come tutte le cose, non avremo un'efficienza del 100%, ma la tecnica è usata frequentemente quando dobbiamo ottenere dei frammenti da un templato limitante.

    Riassumendo:
    · fill in con Kleenow + T4 polinucleotide kinasi + ATP
    · oligo con le ali, dove le ali sono siti di restrizione.
    → I cloni ottenuti devono essere per accertarsi che la DNApol non abbia mutato la sequenza originale.

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