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Marchack
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COSMIDI.
I cosmidi sono DNA circolare ds (come il plasmide pBR322) a cui sono stati aggiunti i siti cos.
Per cui io posso, mantenerlo come plasmide in E.coli, clonare su una resistenza (pBR322 ha la resistenza per Ampicillina e Tetraciclina), e formare grazie a cos i concatameri:
- taglio con Eco dentro una resistenza (per vedere se ho inserito davvero -e in quale colonia- il frammento),
- linearizzo ed aggiungo l'inserto con estremità Eco (cos sono all'interno),
- aggiungo la ligasi
Alla fine ottenendo un DNA ds lineare concatamero che assomiglia a quello di lambda, siccome sto lavorando in vitro, aggiungo code e teste e terminasi e, grazie a cos ho la produzione di particelle fagiche con DNA lineare ds con estremità cos.
In questo modo possono essere utilizzate per infettare E.coli e il DNA lineare ds una volta entrato circolarizza e si replica come un plasmide.
A differenza di lambda non devo indurre la lisi, il plasmide originario è anche più piccolo, quindi posso avere più spazio per il mio inserto (rispettando comunque la lunghezza totale di 52 Kb per l'impaccamento del DNA fagico costruito).
Con i closmidi posso clonare frammenti fino a 40 Kb.
FASMIDI. (FAGEMIDI)
Parte dal DNA fagico di lambda ma modificato. Infatti al posto dei geni per la lisogenia ci sono pezzi di pBR, ed i soliti componenti tipici (ORI, resistenza, linker).
I tanti pezzettini di pBR servono per raggiungere il TOL (lunghezza totale) di 38 Kb. Questo molecola di DNA ha tutte le caratteriastiche di quelle originarie del fago, e quindi può dare origine alla via fagica.
Per avere il fasmide con il frammento da clonare:
- taglio,
- aggiungo il mio inserto, grazie a cos, si formano i concatameri.
- impacco in vitro con teste vuote, code e terminasi.
Ottengo così particellefagiche con cui infetto E.coli. Ora, o ho la replicazione come plasmidi od ho la produzione di fagi.
La scelta se effettuare ciclo litico o meno (replicazione dei fasmidi) la decido io, perchè nel genoma iniziale c'era il repressore di lambda (come in tutti i fagi temperati) temperatura sensibile: sotto ad una certa temperatura il repressore è attivo, inibendo la espressione dei geni per la lisi.
Aumentando la temperatura, invece, inattivo il repressore, i geni per la lisi, si attivano e ho la produzione di particelle fagiche.
Questo sistema non offre vantaggi sulle dimensioni, ma permette di avere, a scelta la via plasmidica fagica. Con la via plasmidica avrò una minore produzione di particelle clonate, rispetto a quelle prodotte attraverso l'espressione fagica, ma posso conservarle meglio (e forse più economicamente).
VETTORI DI CLONAGGIO
Plasmidi = 0 -10 kb
Cosmidi = 0 -20 Kb
Batteriofago P1 = 30 - 40 kb
BAC (cromosomi batterici artificiali) = 70 - 100 Kb
PAC (cromosomi artificiali P1 ) = 130 - 150 Kb
YAC (cromosomi artificiali di lievito) = 0,2 - 2 Mb
MAC (cromosomi artificiali di mammifero) = + di 1 Mb
Fonte
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[GENETICA/BIOLOGIA] Cosmidi e Fasmidi |
